Eine Nanoporenschnittstelle für DNA-Computing mit höherer Bandbreite

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4904 (2022) Diesen Artikel zitieren

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DNA hat sich als leistungsstarkes Substrat für die Programmierung von Informationsverarbeitungsmaschinen im Nanomaßstab erwiesen. Unter den heute verwendeten DNA-Computing-Primitiven ist DNA-Strangverdrängung (DNA-Strang-Verdrängung, DSD) wohl die beliebteste, wobei DSD-basierte Schaltkreisanwendungen von der Krankheitsdiagnostik bis hin zu molekularen künstlichen neuronalen Netzen reichen. Die Ausgänge von DSD-Schaltkreisen werden im Allgemeinen mithilfe der Fluoreszenzspektroskopie gelesen. Aufgrund der spektralen Überlappung typischer fluoreszierender Reporter kleiner Moleküle ist jedoch die Anzahl einzigartiger Ausgänge, die parallel erfasst werden können, begrenzt, was komplexe optische Aufbauten oder räumliche Isolierung von Reaktionen erfordert, um die Ausgangsbandbreiten skalierbar zu machen. Hier stellen wir eine multiplexfähige, sequenzierungsfreie Auslesemethode vor, die eine kinetische Echtzeitmessung der DSD-Schaltkreisaktivität durch hochparallele, direkte Erkennung von Barcode-Ausgangssträngen mithilfe der Nanoporen-Sensor-Array-Technologie (MinION-Gerät von Oxford Nanopore Technologies) ermöglicht. Diese Ergebnisse erhöhen die DSD-Ausgangsbandbreite um eine Größenordnung im Vergleich zu dem, was derzeit mit der Fluoreszenzspektroskopie möglich ist.

Die Vorhersagbarkeit der Franklin-Watson-Crick-Basenpaarung hat den Aufbau einer breiten Palette DNA-basierter Computersysteme ermöglicht, darunter Verstärker1, boolesche Logikgatter2,3,4, chemische Reaktionsnetzwerke5,6, Oszillatoren7, molekulare Diagnostik8 und neuronale Netzwerke4 ,9. Diese Schaltkreise basieren auf einem grundlegenden molekularen Primitiv namens „Toehold-mediated DNA Strand Displacement“ (DSD)10,11. DSD ist eine kompetitive Hybridisierungsreaktion, bei der ein einzelsträngiger DNA- (ssDNA) oder RNA-Input einen etablierten Output-Strang von einem komplementären Bindungspartner verdrängt. Mehrere DSD-Reaktionen können kaskadiert werden, um ein komplexes, aber programmierbares Reaktionsnetzwerk zu schaffen. Aufgrund der Einfachheit dieses Mechanismus und seiner Fähigkeit, sowohl in zellulären als auch in enzymfreien Umgebungen zu funktionieren, finden DSD-Schaltkreise eine breite Anwendung, lassen sich leicht vergrößern und stellen einige der größten molekularen Schaltkreise dar, die bisher von der Menschheit entwickelt wurden.

Das Auslesen der DNA-Strangverdrängungsaktivität beruht typischerweise auf einer Fluorophor-Quencher-Strategie, bei der eine DSD-Reaktion darauf ausgelegt ist, einen mit Fluorophor markierten Strang aus einem mit Quencher markierten Strang freizusetzen. Die Fluoreszenzeigenschaften der Reaktion können dann mit einem Spektrofluorometer gemessen werden, um die relative Konzentration des freien Fluorophor-markierten Strangs zu bestimmen12. Mehrere einzigartige Fluorophore können in einem einzigen System kombiniert werden, um verschiedene DSD-Komponenten zu markieren. Die spektrale Überlappung zwischen Fluoreszenzfarbstoffen (z. B. FAM, TAMRA, Cy5) begrenzt dieses Multiplexing jedoch letztendlich auf etwa 3 oder 4 einzigartige Markierungen13. Selbst dann erfordert das Erreichen dieser Größenordnung orthogonaler Auslesungen eine komplexe und teure Instrumentierung, wie beispielsweise mehrere Sätze optischer Filter14,15,16. Da der Bereich der DNA-Berechnung voranschreitet, sind skalierbarere Erkennungsmethoden von entscheidender Bedeutung für das Schaltkreis-Multiplexing, die mehrschichtige kinetische Charakterisierung und das Debugging2. Im Idealfall wären solche Auslesetechnologien zudem kostengünstig, tragbar und schnell, was Anwendungen wie schnelle Diagnosen unterstützen würde.

Die Nanoporenerkennung ist eine einfache Einzelmolekül-Nachweismethode, die auf eine Vielzahl von Analyten anwendbar ist, von kleinen Molekülen und Peptiden bis hin zu Nukleinsäuren und Proteinen17,18,19,20,21. Die Nanoporen-Array-Technologie wurde kürzlich für die DNA- und RNA-Sequenzierung kommerzialisiert. Zu den Hauptvorteilen der Technologie im Vergleich zu anderen Sequenzierungstechnologien gehören die Portabilität der Instrumente und das Echtzeit-Datenstreaming. Die Nanoporensequenzierung wird durch die enzymunterstützte Translokation von Nukleinsäuresträngen durch die Pore erleichtert, wodurch eine Einzelnukleotidsequenzauflösung langer DNA-Fragmente erreicht werden kann22. Bei diesem Sequenzierungsansatz wird vor der Sequenzierung ein Ligationsschritt durchgeführt, um die Zielstränge an Adapter-DNA-Fragmente zu binden, die an die erforderlichen Motorproteine gebunden sind. Dieses Verfahren ist derzeit für das Auslesen von DSD-Schaltkreisen nicht kompatibel, insbesondere wenn eine Analyse der Schaltkreiskinetik gewünscht wird. Darüber hinaus sind Stränge in DSD-Schaltkreisen normalerweise zu kurz (ca. 15–50 nt), um durch herkömmliche Nanoporensequenzierung zuverlässig charakterisiert zu werden.

Frühere Studien haben nicht-sequenzierungsbasierte Nanoporen-Sensortechniken zur Erkennung von Nukleinsäuresträngen im Kontext der DNA-Berechnung untersucht23. Beispielsweise wurde die Nanoporenerkennung von unmarkierten DNA- und RNA-Schaltkreisausgängen mit Mikrotröpfchensystemen demonstriert, bei denen der Zielstrang elektrophoretisch durch eine Proteinpore gezogen wird, die zwei Tröpfchen verbindet24,25,26. Solche Studien haben jedoch noch nicht gezeigt, dass diese Systeme quantifizierbar oder multiplexierbar sind. Mittlerweile wurden Festkörper-Nanoporen verwendet, um die doppelsträngigen Ergebnisse von DNA-Assemblierungsreaktionen27 und das Vorhandensein/Fehlen von Streptavidin-basierten DSD-Ausgabemarkierungen28 zu charakterisieren, sind aber auch schwer zu multiplexen. Neben der DNA-Berechnung wurde die Nanoporentechnologie auch für den miRNA-Nachweis eingesetzt, was die Krankheitsdiagnose erleichtert23,29. Weitere Studien in diesem Bereich zeigten, dass Peptidnukleinsäure (PNA) und Polyethylenglykol (PEG)-Sonden wirksam auf spezifische miRNAs für die Nanoporenerkennung abzielen30,31. Es bleibt jedoch auch weiterhin eine Herausforderung, den Nachweis mehrerer miRNAs mithilfe dieser Sonden zu multiplexen.

Hier haben wir eine multiplexbare Berichtsstrategie entwickelt, die handelsübliche Nanoporen-Sensorarray-Technologie (MinION von Oxford Nanopore)22 nutzt, um viele DSD-Schaltkreisreaktionen dynamisch in Echtzeit zu überwachen und so eine skalierbarere Auslesung der Ausgangskinetik mit einem kostengünstigen, tragbaren Gerät zu ermöglichen . Zunächst demonstrieren wir die erfolgreiche kinetische Charakterisierung eines einzelnen DSD-Schaltkreises, der in einer Nanoporen-Array-Durchflusszelle arbeitet, mit Ergebnissen, die mit herkömmlichen fluoreszenzbasierten Berichtssystemen vergleichbar sind. Anschließend entwerfen und charakterisieren wir Dutzende von Nanoporen-Barcodes, die für die Multiplex-DSD-Schaltkreisberichterstattung verwendet werden können. Bei dieser Strategie werden Barcodes mithilfe von maschinellem Lernen direkt aus rohen Nanoporensignaldaten klassifiziert. Schließlich implementieren wir diese Berichtsstrategie, um zwischen Kombinationen von drei Einzelnukleotidvarianten (SNVs) der let-7-microRNA-Familie zu unterscheiden.

Um unsere Berichtsmethode zu entwickeln, haben wir zunächst eine modifizierte DNA-Strang-Architektur entworfen, die es uns ermöglichen würde, ssDNA-DSD-Ausgänge mithilfe einer Nanopore zu erfassen (Abb. 1a). Dies erreichten wir, indem wir den Ausgangsstrang so modifizierten, dass er eine 3'-Biotin-Modifikation enthielt. Wir gingen davon aus, dass diese Modifikation bei Konjugation mit Streptavidin verhindern würde, dass verdrängte ssDNA vollständig durch die Nanopore transloziert, nachdem ihr freies 5'-Ende elektrophoretisch eingefangen wurde. Das Nanoporen-Ionenstromsignal wäre dann von der Sequenz des in der Pore immobilisierten Strangs abhängig18,32,33. Um diesen Ansatz zu verifizieren, testeten wir Biotin-modifizierte DNA-Stränge in Gegenwart von Streptavidin auf einem MinION-Nanoporen-Sensor-Array mithilfe eines benutzerdefinierten Laufskripts, das die angelegte Spannung über das Nanoporen-Array alle zehn Sekunden kurz umkehrte, sodass wir wiederholt Stränge aus dem Nanoporen-Array einfangen konnten Massenlösung und dann elektrophoretisch auswerfen34. Durch die wiederholte Probenahme von Strängen aus der Bulk-Flow-Zelllösung auf diese Weise konnten wir DNA-spezifische Nanoporen-Einfangereignisse mit einer konzentrationsabhängigen Häufigkeit nachweisen (Abb. 1b – d).

eine DSD-Schaltkreiserkennung mit einem Nanoporensensor. Schaltkreiskomponenten werden gemischt und zur Echtzeitauslesung auf ein Nanoporen-Sensorarray geladen. Eingangsstränge reagieren mit dem Gate-Komplex und verdrängen die mit einem Barcode versehene und 3'-markierte Biotin-Streptavidin-Ausgangs-ssDNA, die dann frei ist, um von einem Nanoporensensor eingefangen und gelesen zu werden. Das Nanoporen-Sensor-Array ist in der Lage, verschiedene Ausgangsstrang-Barcodes zu unterscheiden und ermöglicht so das Multiplexen von Schaltkreisen. b Beispiel-Nanoporen-Rohdaten, die das wiederholte Einfangen und Auswerfen von biotinylierten ssDNA-Ausgabesträngen zeigen. Bei DNA-Einfangereignissen kommt es zu einem Abfall des Ionenstroms von der offenen Pore auf ein niedrigeres Ionenstromniveau. Durch Umkehr der angelegten Spannung werden Stränge aus der Pore ausgeworfen. c Histogramm, das die Verteilung des mittleren Teilstroms aus Einfangereignissen zeigt, die zu drei Proben gehören: Nanoporen-Laufpuffer, Laufpuffer mit 4 µM Streptavidin und Laufpuffer mit sowohl 4 µM Streptavidin als auch 0,5 µM 3'-biotinylierter ssDNA. d Standardkurve, die die Beziehung zwischen der durchschnittlichen Zeit zwischen dem Einfangen des Ausgangsstrangs und der Strangkonzentration zeigt. Fehlerbalken stellen ± Standardabweichung von drei Replikaten dar, wobei jedes Replikat einen anderen Strang mit Barcode verwendet.

Nachdem wir bestätigt hatten, dass wir freie Biotin-Streptavidin-modifizierte ssDNA-Stränge nachweisen konnten, testeten wir als Nächstes, ob diese Technik gekoppelt werden kann, um die Konzentration der freien Ausgangsstränge einer katalytischen Wippen-basierten DSD-Reaktion zu erfassen (Abb. 2a, b). Wippenschaltungen wurden bisher zum Aufbau großer Logikschaltungen und neuronaler Netze verwendet2,4,9. In dieser Schaltungsarchitektur (Schaltung 1 mit Barcode A1, siehe Ergänzungstabellen 1 und 2) verdrängt ein Eingangsstrang einen Gate-gebundenen Ausgangsstrang. Ein Treibstoffstrang verbindet sich dann mit dem Gate und verdrängt den Input, wodurch dieser frei wird, um einen größeren Teil des Outputs auszulösen. Somit kann ein Wippentor seinen Eingang katalytisch verstärken, ein entscheidender Schritt für die Wiederherstellung von Signalen. Eine katalytische Reaktion kann den Gesamtverdrängungsprozentsatz um bis zu 100 % erhöhen2,35, und der Vergleich zwischen einer katalytischen Reaktion und einer nichtkatalytischen Reaktion ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt. Um die Erkennung des Ausgangsstrangs des Wippentors zu ermöglichen, haben wir entworfen der Strang mit der erforderlichen 3'-Biotin-Modifikation, zusätzlich zu einem kurzen PolyT-Linker zwischen dieser Modifikation und dem Rest der Sequenz. Anschließend hybridisierten wir den Ausgangsstrang mit dem komplementären Gate-Strang, um den Gate-Komplex zu bilden. Der mit Streptavidin gebundene Gate-Komplex wurde dann unter zwei verschiedenen Bedingungen in eine MinION-Durchflusszelle gegeben: mit und ohne Anwesenheit eines Eingangsstrangs. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Abb. 2c dargestellt (Rohspuren in der ergänzenden Abb. 2). Insbesondere haben wir die durchschnittliche Nanoporenstrang-Einfangfrequenz des Ausgangsstrangs in 5-Minuten-Intervallen bestimmt, sodass wir die Reaktionskinetik direkt in der Durchflusszellenlösung messen konnten (Methoden). Parallel dazu haben wir auch eine identische Reaktion mit einem herkömmlichen Reporter-Gate und Fluorometer auf Fluorophor-Quencher-Basis überwacht (Abb. 2b, c). Wir fanden heraus, dass Nanoporenproben eine vergleichbare Ausgangskinetik aufwiesen wie diejenigen, die mit dem Fluorophor-Quencher-Ansatz gemessen wurden, was darauf hindeutet, dass unsere Nanoporenmethode zur genauen Überwachung der Reaktionskinetik einer katalytischen DSD-Reaktion verwendet werden kann. Wir stellten außerdem fest, dass Proben ohne hinzugefügten Input bei Verwendung der Fluoreszenz-Berichtsmethode ein höheres Maß an Output-Strang-Leckage aufwiesen. Wir stellten die Hypothese auf, dass dieser Schaltkreisverlust durch die Wechselwirkung zwischen dem Wippentor und dem Fluoreszenz-Reporter-Gate2 verursacht wurde (Abb. 2b). Da unsere Nanoporen-Auslesestrategie den ssDNA-Ausgabestrang direkt erkennt, ist kein zusätzliches Reporter-Gate erforderlich, sodass das Reporter-Leck im Nanoporen-basierten Kinetikdiagramm nicht beobachtet wurde. Um diese Hypothese zu überprüfen, haben wir ein festgeklemmtes Wippentor getestet (Ergänzungstabelle 3), von dem zuvor gezeigt wurde, dass es Reporterlecks unterdrückt2. Tatsächlich stimmte die Kinetik der Probe ohne Eingabe unter Verwendung eines geklemmten Wippentors eher mit der Anzeige der Nanoporen ohne Eingabe überein (ergänzende Abbildung 3). Wir haben auch bestätigt, dass die Eingangsstränge, Brennstoffstränge und Zwischenkomplexe des Schaltkreises nicht als Erfassungen von unserer Analysepipeline extrahiert werden und daher nicht zu unserer gemessenen Ausgangskonzentration beitragen (Ergänzende Abbildungen 4 und 5). Darüber hinaus stellen wir fest, dass der Gate-Komplex einen 15-nt-Überhang enthielt, um ihn mit dem Fluoreszenz-Reporter-Gate kompatibel zu machen, und dass dieser Überhang die Hintergrundeinfangrate des Ausgangsstrangs in der Pore erhöht, aber durch Normalisierung gegen den Hintergrund (d. h keine Eingabebedingungen) (siehe Methoden). Das Einfangen des Gate-Komplexes kann erheblich reduziert werden, indem die D6-Überhangdomäne aus dem in Abb. 2a gezeigten Ausgangsstrang entfernt wird (ergänzende Abb. 6).

a Diagramm eines katalytischen Wipp-DSD-Schaltkreises. Der einzelsträngige Eingang verdrängt den 3'-markierten einzelsträngigen Biotin-Streptavidin-Ausgang aus dem Gate-Komplex und bildet ein Zwischenprodukt mit dem unteren Strang. Der verdrängte Ausgangsstrang kann nun in einer Nanopore eingefangen werden. Einzelsträngiger Kraftstoff verdrängt den Input aus dem Zwischenprodukt und recycelt den Input. b Verdrängte Ausgabe-ssDNA kann mit zwei Detektionsstrategien ausgelesen werden: (i) Spektrofluorometer-basierte Detektion. Der Ausgangsstrang verdrängt den mit einem Quencher markierten Strang aus einem mit einem Fluorophor markierten Reporter-Gate-Komplex und löst so Fluoreszenz aus. Bei dieser Reporterstrategie kann es zu einer Stapelung mit stumpfen Enden kommen, bei der ein doppelsträngiger Gate-Komplex den Quencher-Strang verdrängt, was zu unerwünschter Leckfluoreszenz führt. (ii) Nanoporenbasierter Nachweis. Ein einzelsträngiger Ausgangsstrang wird durch einen Eingangsstrang verdrängt und kann dann in einer Nanopore eingefangen werden, was zu einem erkennbaren Abfall des Ionenstroms führt, der die Barcode-Sequenz des Strangs diagnostiziert. c Diagramm der DSD-Reaktionskinetik, bestimmt durch Nanoporen (rosa) und zum Vergleich mit einem Spektrofluorometer (grün), das die normalisierte Konzentration des Ausgangsstrangs nach Zugabe des Eingangs zeigt.

Nachdem wir eine Technik zur Messung der DSD-Kinetik einer einzelnen Reaktion mithilfe eines Nanoporen-Arrays entwickelt hatten, versuchten wir als Nächstes, die Multiplex-Detektion durch Barcode-Kennzeichnung des Ausgangsstrangs zu untersuchen. Wir begannen mit der Bestimmung des durch Nanoporen adressierbaren Bereichs des Ausgangsstrangs. Zu diesem Zweck haben wir eine Reihe von ssDNA-Ausgabesträngen entworfen und getestet, die eine einzelne Nukleotidvariation an einer anderen Position innerhalb eines Neun-Nukleotid-Fensters direkt stromaufwärts des biotinylierten 3'-Endes enthielten. Wir fanden heraus, dass Mutationen innerhalb einer Sechs-Nukleotid-Untergruppe dieses Fensters erhebliche Veränderungen des mittleren Ionenstromsignals im Vergleich zum ursprünglichen Ausgangsstrang zeigten (Abb. 3a und ergänzende Abb. 7). Wir haben diesen sensiblen Sequenzbereich als nanoporenadressierbaren Barcode des Ausgangsstrangs bezeichnet.

a Kartierung der nanoporenempfindlichen Region des Ausgangsstrangs. Das Diagramm zeigt die absolute Änderung des mittleren fraktionierten Ionenstroms, die sich durch eine Einzelnukleotidmutation an verschiedenen Positionen entlang des Strangs manifestiert. b Dichtediagramm, das die Verteilung des mittleren Bruchstroms für jeden Barcode in Satz A zeigt. Jede Verteilung besteht aus ~14500 Datenpunkten. c Zur Durchführung der Klassifizierung wird ein Zwei-Sekunden-Fenster (20.000 Datenpunkte) des ausgegebenen Strang-Capture-Ereignissignals extrahiert, in ein 2D-Array umgeformt und dann als Eingabe für ein 2D-ResNet-18-CNN verwendet. Die Ausgabe des CNN ist eine Barcode-Vorhersage. d Verwirrungsmatrix, die Klassifizierungsergebnisse der CNN-Inferenz auf einem Barcode-Testsatz zeigt, der eine durchschnittliche Einzelmolekülgenauigkeit von 72 % erreichte. e DSD-Reaktionskinetikdiagramm von zwei verschiedenen Schaltkreisen (Barcode mit A0 oder A5), die auf dem Nanoporengerät gemultiplext sind. Jeder Gate-Komplex war mit 0,5 µM vorhanden, der Brennstoffstrang mit 2 µM, der Eingangsstrang mit 0,2 µM und Streptavidin mit 2 µM. Es wurden zwei Proben vorbereitet: ohne Eingabe und mit Eingabe. Das linke Diagramm zeigt die Erkennung der Barcode-A0-Ausgabe für beide Proben. Das rechte Diagramm zeigt die Erkennung der Barcode-A5-Ausgabe für beide Proben.

Als ersten Test, um zu sehen, wie genau Barcodes unterschiedlicher Sequenzen voneinander unterschieden werden können, haben wir zufällig einen Satz von zehn verschiedenen Ausgabesträngen adressiert (Schaltkreise 0–9 mit Barcodes A1–A9, siehe auch Ergänzungstabellen 1 und 2). Ergänzende Abbildung 8) und charakterisierte sie auf einem MinION. Die fraktionierten Durchschnittsströme des Erfassungsereignisses für jeden dieser Barcodes zeigten, dass einige der Barcodes zwar unterschiedliche Signalpegel aufwiesen, was auf eine hohe Trennbarkeit allein aufgrund dieses Merkmals hinweist, einige Barcodes jedoch erhebliche Überlappungen aufwiesen (Abb. 3b und ergänzende Abb. 9). Die Anpassung eines logistischen Regressionsmodells an diese Mittelwerte ergab eine Einzelmolekül-Klassifizierungsgenauigkeit von ~32 % bei einem zurückgehaltenen Testsatz (Methoden). Unterdessen ergab ein Random-Forest-Modell, das auf fünf Merkmale des Rohsignals (Mittelwert, Median, Standardabweichung, Maximum und Minimum) trainiert wurde, eine Genauigkeit von ~64 % (ergänzende Abbildung 10). Um mehr Signalinformationen zu erfassen, die eine bessere Unterscheidung zwischen den verschiedenen Barcodes ermöglichen könnten, verwendeten wir ein 4-schichtiges Convolutional Neural Network (CNN), um die Merkmalsextraktion und -klassifizierung direkt aus dem rohen Nanoporensignal zu automatisieren (Abb. 3c und Methoden). CNN-Modelle, die auf Daten trainiert wurden, die für jeden der zufälligen Barcodes gesammelt wurden, ergaben bei einem zurückgehaltenen Testsatz eine Einzelmolekül-Klassifizierungsgenauigkeit von ~72 % (Abb. 3d und Methoden). Anschließend haben wir zwei Barcodes aus diesem Satz ausgewählt (Barcodes A0 und A5) und sie als Ausgabereporter für zwei orthogonale Wippentore getestet (Abb. 3e). Dies erreichten wir, indem wir die beiden Wippe-Schaltkreise (Kreise 0 und 5) in Lösung vermischten und dann unmittelbar vor dem Laden in eine MinION-Durchflusszelle selektiv den einen oder anderen durch Zugabe des entsprechenden Eingangsstrangs auslösten, abhängig von den experimentellen Bedingungen. Anschließend quantifizierten wir die Reaktionskinetik jedes Schaltkreises im Verlauf des Experiments mithilfe des CNN, um die Ausgangsstrang-Einfangsignale zu demultiplexen. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigten, dass nur der selektiv ausgelöste Schaltkreis-Barcode in jeder der beiden Versuchsbedingungen ein erhöhtes Ausgangssignal aufwies, was darauf hinweist, dass unser Klassifikator in der Lage war, die vorhandenen und aktivierten Barcode-Schaltkreise vor dem Hintergrund nicht aktivierter Barcodes korrekt zu identifizieren oder nicht in der Probe vorhanden (Abb. 3e und ergänzende Abb. 11).

Um das Multiplex-Potenzial dieser Methode weiterzuentwickeln, haben wir als Nächstes zwei Sätze rational gestalteter Barcodes getestet (Sätze B und C, siehe Ergänzungstabelle 2 und Ergänzungsabbildung 8). Satz B basierte auf einem prädiktiven Nanoporensignalmodell von DNA-Kmeren , mit dem wir einen Satz von dreizehn 6-kmer-Barcodesequenzen ausgewählt haben, von denen vorhergesagt wurde, dass sie nahezu nicht überlappende Ionenstromniveaus aufweisen (ergänzende Abbildung 12). Set C beinhaltete die Verwendung abasischer Sites innerhalb der Barcode-Sequenz. Wir kamen zu dem Schluss, dass abasische Stellen, denen eine stickstoffhaltige Base fehlt, höhere Ionenstromniveaus ergeben würden als Barcodes, die vollständig aus Standardbasen bestehen, wodurch der dynamische Bereich des Barcode-Signalraums erweitert würde. Insgesamt haben wir 36 verschiedene Barcodes charakterisiert, die wir mithilfe des 4-Schicht-CNN mit einer nicht trivialen Einzelmolekülgenauigkeit von ~60 % untereinander klassifizieren konnten. Darüber hinaus haben wir die Genauigkeit der Barcode-Klassifizierung mit ResNet-18 verglichen, einem leistungsfähigeren CNN, das in Computer-Vision-Anwendungen beliebt ist37. Das ResNet-18-Modell ergab verbesserte 36-Wege-Klassifizierungsgenauigkeiten von ~93 % und ~67 %, mit und ohne Verwendung eines Klassifikator-Konfidenzfilters (Abb. 4a, ergänzende Abb. 13 und Methoden). Aus dieser Sammlung identifizierten wir eine Teilmenge von zehn Barcodes mit den am besten trennbaren Signalpegeln (Abb. 4b und ergänzende Abb. 14) und erreichten nach dem Training und Testen des ResNet-18 eine durchschnittliche Einzelmolekül-Klassifizierungsgenauigkeit von ~ 96–97 % CNN zu diesem begrenzten Satz (Abb. 4c und ergänzende Abb. 13). Anschließend führten wir eine weitere Reihe von Multiplex-Wippschaltungsexperimenten unter Verwendung dieser Teilmenge optimierter Barcodes und des entsprechenden CNN-Klassifikators durch. In diesen Experimenten wurden bis zu drei Schaltkreise gleichzeitig in Proben aktiviert, die insgesamt fünf orthogonale Wippenschaltkreise enthielten. Im Gegensatz zu unseren vorherigen Nanoporenexperimenten wurden Eingangsstränge in die Proben eingeführt und die Reaktionen konnten vor der Analyse an der Nanopore einen stationären Zustand erreichen (Methoden). Insbesondere wurde unser Klassifikator damit beauftragt, alle zehn Barcodes in unserem optimierten Satz zu unterscheiden, obwohl nur fünf davon (Barcodes B10, B7, C13, C8 und C12) in den Proben physisch vorhanden waren und zwei (Barcodes B7 und C12). ) oder drei (Barcodes B10, C13 und C8) dieser Schaltkreise wurden je nach Versuchsbedingungen mit ihren entsprechenden Eingangssträngen aktiviert. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Abb. 4d dargestellt (Rohspuren in der ergänzenden Abb. 15). Wir haben festgestellt, dass Schaltkreise mit aktivierten Barcodes in jeder Probe im Vergleich zu allen anderen Barcodes erhöhte Erfassungswerte aufwiesen. Diese Ergebnisse zeigen die Fähigkeit unserer Nanoporen-Berichtsstrategie, DSD-Schaltkreisauslesungen zu multiplexen, die über das hinausgehen, was mit aktuellen fluoreszenzbasierten Technologien möglich ist.

eine Verwirrungsmatrix, die die Ergebnisse von ResNet-18 CNN zeigt, das auf allen 36 charakterisierten Barcodes trainiert wurde. CNN erreichte im Testsatz eine Genauigkeit von ~67 %. b Dichtediagramm, das die Verteilung des mittleren Bruchstroms für jeden für den hochtrennbaren Satz ausgewählten Barcode zeigt. Jede Verteilung besteht aus ca. 13.000 Datenpunkten. c Verwirrungsmatrix, die die Ergebnisse von ResNet-18 CNN zeigt, das nur auf die ausgewählten hochtrennbaren Barcodes trainiert wurde und im Testsatz eine Genauigkeit von 93 % erreichte. d Balkendiagramme zum Vergleich normalisierter Erfassungsfrequenzen jedes Schaltkreisausgangs in zwei gemultiplexten Abtastwerten. Die Schaltkreise 1, 5, 7, 8 und 9 (mit den Barcodes B10, B7, C13, C8 bzw. C12, siehe Ergänzungstabellen 1 und 2) waren in jeder Probe vorhanden. Im linken Diagramm wurden Eingaben für die Schaltkreise 0 und 5 hinzugefügt. Im rechten Diagramm wurden Eingaben für die Schaltkreise 1, 7 und 8 hinzugefügt. Jeder Gate-Komplex war mit 0,2 µM vorhanden, Input mit 0,2 µM und Streptavidin mit 3,2 µM. Fehlerbalken stellen ± Standardabweichung von drei biologischen Replikaten dar.

Schließlich versuchten wir, unser Reportersystem in einer Multiplex-Diagnoseanwendung zu testen, indem wir zwischen Kombinationen von Einzelnukleotidvarianten (SNVs) der let-7-microRNA-Familie (miRNA) unterschieden. Die let-7-Familie der miRNAs spielt eine wichtige Rolle in der menschlichen Entwicklung und kann als Biomarker für Erkrankungen wie Krebs verwendet werden38. Inspiriert von Chen et al.39 haben wir kompetitive dreisträngige Sonden für den Nachweis von drei Varianten entwickelt: let-7a, let-7e und eine verkürzte Version von let-7c (Abb. 5a, b, auch Ergänzungstabelle 4). . Let-7c wurde gekürzt, um potenzielles Sonden-Crosstalk zu reduzieren, indem eine unerwünschte Wobble-Basenpaarung zwischen let-7c-miRNA und let-7a-Sonde destabilisiert wurde. Wir haben drei Barcodes aus unserem entworfenen Satz ausgewählt und der Sonde jeder Variante einen anderen zugewiesen und dann einen Drei-Wege-ResNet-18-basierten Klassifikator trainiert, um zwischen diesen Barcodes zu unterscheiden. Wenn eine bestimmte miRNA-Variante vorhanden ist, sollte die entsprechende Sonde ausgelöst werden, sodass der mit dem Barcode versehene Ausgangsstrang vom Nanoporen-Sensorarray erkannt werden kann. Um eine Verstärkung der Übersprechleckage zu vermeiden, haben wir für unsere Sonden keine Brennstoffstränge verwendet. Wir haben diese Strategie mit Experimenten getestet, die alle drei Sonden in einer einzigen Reaktionslösung enthielten, die wir dann vor der Messung mit einem MinION mit verschiedenen Kombinationen von let-7a-, let-7c- und let-7e-RNA-Eingaben herausgefordert haben. Die Ergebnisse dieser Experimente zeigten eine deutliche Anreicherung der Barcodes, die den Sonden entsprachen, die durch ihren zugehörigen RNA-Input ausgelöst wurden (Abb. 5c und ergänzende Abb. 16). Obwohl größtenteils orthogonal, wurde ein RNA/Sonden-Übersprechen in dem Fall beobachtet, in dem die Zugabe von let-7e-Eingabe die Freisetzung von let-7a-Sondenausgabe leicht über dem Hintergrundniveau auslöst. Dies ist wahrscheinlich auf den relativ großen Abstand zwischen dem let-7e-SNV und der toehold-komplementären Region (T1*) zurückzuführen, der den kinetischen Nachteil der Hybridisierung von let-7e-Eingaben mit let-7a-Sonden verringert. Diese Ergebnisse stimmen auch mit Messungen auf Fluoreszenzreporterbasis überein, was darauf hinweist, dass dieses Übersprechen nicht auf unsere Reporter auf Nanoporenbasis zurückzuführen ist (ergänzende Abbildung 17). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse ein erfolgreiches Multiplexing eines microRNA-basierten Diagnostikums.

ein zweistufiger Sondenmechanismus. Der miRNA-Input hybridisiert mit der ersten Halteregion (T1) am unteren Strang und verdrängt den mit dem Barcode versehenen Output-Strang für die Nanoporen-Auslesung. Als nächstes hybridisiert ein Helferstrang mit der zweiten Halteregion (T2) am unteren Strang, verdrängt den Quencherstrang und ermöglicht eine spektrofluorometerbasierte Auslesung. b Multiplex-Experimentaufbau. Eingabestränge sind synthetische let-7-miRNA-SNV-Varianten (Sequenzen mit rot hervorgehobenen SNVs), die einem Sondenmix hinzugefügt werden. Ein rotes X kennzeichnet die Position der zu SNVs komplementären Basen. Durch die Hybridisierung eines Inputs mit der richtigen Sonde wird der entsprechende Barcode-Output für die Nanoporenerkennung freigegeben. c Sieben Proben, die jeweils drei let-7-Sonden enthielten, wurden vorbereitet. Jeder Stichprobe wurde eine andere Kombination von Eingabesträngen hinzugefügt, wie unter jeder Balkengruppe dargestellt. Das Balkendiagramm zeigt die Einfangfrequenz jedes Barcode-Ausgangssignals in jeder Probe, gemessen an der Nanopore nach Erreichen eines stationären Zustands. Fehlerbalken stellen ± Standardabweichung von drei biologischen Replikaten dar.

Zusammenfassend haben wir eine Reporterstrategie für DSD-Reaktionen mithilfe der Nanoporenerkennung entwickelt. Unser System bietet entscheidende Vorteile gegenüber fluoreszenzbasierten Methoden, einschließlich eines besseren Multiplexings und einer Echtzeitauslesung mithilfe eines kostengünstigen, tragbaren Geräts mit Durchflusszellen, das für mehrere analytische Proben wiederverwendet werden kann (ergänzende Abbildung 18). Darüber hinaus verwendet unsere Methode im Vergleich zu auf Fluorophor-Quencher-Paaren basierenden Reportersystemen DNA-Sequenz-basierte Barcodes (keine kleinen Moleküle) und erfordert daher nur eine einzige Art von DNA-Modifikation (Biotinylierung), die einfacher zu synthetisieren ist und nicht anfällig dafür ist Photobleichung. Zu den möglichen Einschränkungen unserer Nanoporenschnittstelle gehören jedoch eine geringere Empfindlichkeit im Vergleich zu Fluorometern, eine geringere Zeitauflösung und die Unfähigkeit, Proben unter verschiedenen Bedingungen zu multiplexen, da es keine physikalischen Barrieren zur Trennung von Proben in einer Durchflusszelle gibt. Ein weiterer Bereich mit potenzieller Verbesserung ist die Vorhersagegenauigkeit des Klassifikators, die durch den Klassifikatortyp und die Anzahl der Trainingsbeispiele (ergänzende Abbildung 19) oder durch die Festlegung eines Konfidenzschwellenwerts (ergänzende Abbildung 13) beeinflusst werden kann. Zukünftige Arbeiten zielen auf Folgendes ab: 1) eine weitere Erweiterung des Barcode-Raums, beispielsweise durch chemische Modifikationen der DNA, die den dynamischen Bereich des Barcode-Signalraums erweitern könnten40 und/oder die Fähigkeit, aufeinanderfolgende Barcode-Regionen innerhalb einer einzelnen Ausgabe zu lesen Strang25,41,42; und 2) Erhöhung der Reaktionsgeschwindigkeit und Empfindlichkeit von DSD-Reaktionen, beispielsweise durch räumliche Lokalisierung von DNA-Komponenten auf der Nanoporen-Sensormembran43,44. Durch die Erhöhung des Umfangs und der Geschwindigkeit unserer Detektionsstrategie für komplexere molekulare Computerarchitekturen wie kaskadierte Schaltkreise oder Oszillatoren werden wir die Fähigkeit unserer Methode, sowohl Multiplex- als auch kinetische Auslesungen zu generieren, noch weiter ausnutzen. Diese Fortschritte würden die Fähigkeiten molekularer Computerwerkzeuge erweitern, indem sie den Entwurf und die einfache Charakterisierung komplexerer Schaltkreise erleichtern und neue Möglichkeiten für deren Anwendung in der medizinischen Diagnostik45, Therapeutik46, biomolekularen Instrumenten47 und molekularer Informationsverarbeitung4,8 eröffnen.

Alle MinION-Läufe wurden mit R9.4.1-Durchflusszellen (Oxford Nanopore Technologies) durchgeführt. Alle Läufe wurden bei einer Temperatur von 30 °C, einer Vorspannung von –180 mV, einer Abtastfrequenz von 10 kHz und einer statischen Flip-Frequenz von 15 Sekunden unter Verwendung eines benutzerdefinierten MinKNOW-Skripts (erhältlich bei ONT) konfiguriert, das die Erfassung ermöglicht von aktuellen Rohdaten. Alle Proben wurden in 1X C17-Puffer (2 M KCl, 100 mM HEPES, pH 8) suspendiert. Die Proben wurden in den Priming-Port der Durchflusszelle pipettiert. Wenn mehrere Proben auf derselben Durchflusszelle laufen, wurde die Durchflusszelle zwischen den Proben 5 Minuten lang mit 3 ml 1X C17 gewaschen. Bei Nichtgebrauch wurden die Durchflusszellen bei 4 °C in C18-Puffer (150 mM Kaliumferrocyanid, 150 mM Kaliumferricyanid, 25 mM Kaliumphosphat, pH 8) gelagert.

Alle DSD-Schaltkreiskomponenten wurden bei Integrated DNA Technologies (IDT) bestellt. Alle Komponenten wurden langfristig bei −20 °C und kurzfristig (weniger als einen Monat) bei 4 °C gelagert. Schaltkreis-Gate-Komplexe wurden durch Mischen von 4 nmol Ausgangsstrang mit 4 nmol unterem Strang in 0,8X C17 konstruiert. Die Stränge wurden in einem Thermocycler getempert, beginnend bei 95 °C für 2 Minuten und einer Verringerung um 1 °C alle 1 Minute über 75 Zyklen. New England Biolabs (NEB) Purple Gel Loading Dye (kein SDS) wurde dem getemperten Produkt in einer Endkonzentration von 1X zugesetzt. Das doppelsträngige angelagerte Produkt wurde dann auf einem 10 %igen nicht denaturierenden Polyacrylamidgel von überschüssiger ssDNA getrennt. Dem getemperten Produkt entsprechende Banden wurden geschnitten und zum Eluieren mindestens 24 Stunden lang in 1X C17 getaucht.

Fluoreszierende Reporter wurden durch Mischen von Quenchersträngen in 30 % höherer Konzentration als Fluorophorstränge in 1X C17 hergestellt. Die Stränge wurden unter Verwendung des oben beschriebenen Thermocycler-Protokolls getempert.

Die Standardkurve ist ein Durchschnitt der Titrationsdaten von drei verschiedenen Ausgangssträngen. In jedem Titrationsexperiment wurde der Ausgangsstrang auf dem MinION in Konzentrationen von 0,02, 0,1, 0,2, 0,5 und 1 µM laufen gelassen. Jede Probe enthielt außerdem Streptavidin (NEB #N7021S) in einer Menge von 4 µM und war in 1X C17 suspendiert. Um sicherzustellen, dass genügend Aufnahmen für die Datenanalyse bei niedrigen Konzentrationen gesammelt wurden, wurde die 0,02-µM-Probe 20 Minuten lang, die 0,1-µM-Probe 15 Minuten lang und die restlichen Proben 10 Minuten lang laufen gelassen.

Die Probe für dieses Experiment bestand aus 0,5 µM Gate-Komplex, 2 µM Streptavidin und 2 µM Treibstoffstrang, suspendiert in 1X C17, zu einem Gesamtvolumen von 200 µL. Unmittelbar vor dem Laden in die MinION-Durchflusszelle wurden 0,2 μM Eingangsstrang hinzugefügt, um die Reaktion zu starten. Auf dem MinION wurden über einen Zeitraum von vier Stunden Daten zum Ionenstrom gesammelt. Die durchschnittliche Zeit zwischen den Erfassungen (TBC) wurde für jedes Fünf-Minuten-Intervall während des Laufs berechnet und wie folgt normalisiert, wobei TBCbackground der durchschnittliche TBC der ersten fünf Datenpunkte in der Probe ohne Eingabe und TBCsaturated der durchschnittliche TBC von 0,5 µM ist freier Ausgangsstrang, einzeln gemessen in einer separaten Probe.

Fluoreszenzkinetikdaten desselben Kreislaufs bei einem Gesamtvolumen von 100 µL wurden alle 1 Minute mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Synergy HTX, Multi-Mode-Lesegerät, Biotek) erfasst. Die Anregungswellenlängen (Emissionswellenlängen) betrugen 485 nm (528 nm) für den Farbstoff FAM und 620 nm (680 nm) für den Farbstoff Cy5. Die Probenzusammensetzung war identisch mit der Nanoporenprobe, außer dass ein fluoreszierendes Reporter-Gate bei 3 µM hinzugefügt wurde.

Die Proben für das Multiplexing-Experiment mit zwei Schaltkreisen bestanden aus 0,5 µM Gate-Komplex und 2 µM Treibstoffstrang aus jedem Schaltkreis sowie insgesamt 4 µM Streptavidin, suspendiert in 1X C17, bis zu einem Gesamtvolumen von 200 µL. Unmittelbar vor dem Laden in die MinION-Durchflusszelle wurden 0,2 µM Input für jeden Kreislauf hinzugefügt.

Die Proben für das Multiplex-Experiment mit fünf Schaltkreisen bestanden aus 0,2 µM Gate-Komplex aus jedem Schaltkreis und insgesamt 3,2 µM Streptavidin, suspendiert in 1X C17, bis zu einem Gesamtvolumen von 200 µL. Den Proben wurden 0,4 µM jedes gewünschten Inputs zugesetzt, diese wurden dann sofort in einen Inkubator mit 30 °C gegeben und über einen Zeitraum von drei Stunden reagieren gelassen, um einen stabilen Zustand zu erreichen (die Schaltkreise wurden zuvor auf einem Fluorometer charakterisiert, um sicherzustellen, dass drei Stunden ausreichend sind). Zeit bis zum Erreichen des Steady-State, den wir als den Punkt definieren, an dem sich die Ausgangsfluoreszenz für mindestens eine Stunde nicht um mehr als 5 % ändert. Anschließend wurden die Proben zur Analyse in eine MinION-Durchflusszelle geladen. Jede Probe wurde 10 Minuten lang laufen gelassen.

Alle let-7-Sondenkomponenten wurden bei IDT bestellt. Hilfsstränge und Treibstoffstränge wurden PAGE-gereinigt, während alle anderen Stränge HPLC-gereinigt wurden. Alle Komponenten wurden langfristig bei −20 °C und kurzfristig (weniger als einen Monat) bei 4 °C gelagert. Sonden wurden durch Mischen von Ober- und Ausgangssträngen konstruiert, jeweils in einer um 20 % höheren Konzentration als die Unterstränge in 1X C17. Die Stränge wurden in einem Thermocycler getempert, beginnend bei 95 °C und mit einer Absenkung um 1 °C alle 1 Minute über 75 Zyklen. Glycerin wurde den getemperten Produkten in einer Endkonzentration von 10 Vol.-% zugesetzt. Der angelagerte Komplex wurde dann auf einem 10 %igen nicht denaturierenden Polyacrylamidgel von überschüssiger ssDNA getrennt. Dem getemperten Produkt entsprechende Banden wurden ausgeschnitten und zum Eluieren mindestens 24 Stunden lang in 1X C17 getaucht.

Proben für den Multiplex-Nachweis von let-7-SNVs bestanden aus 100 nM jeder let-7-Sonde, 130 nM jedes let-7-Helferstrangs und 1200 nM Streptavidin, suspendiert in 1X C17, zu einem Gesamtvolumen von 200 ul. 50 nM jeder gewünschten let-7-microRNA wurden zu den Proben hinzugefügt, die dann sofort in einen Inkubator bei 30 °C gegeben wurden und über eine Stunde hinweg reagieren konnten, bis sich ein stabiler Zustand ergab. Anschließend wurden die Proben zur Analyse in eine MinION-Durchflusszelle geladen. Jede Probe wurde 10 Minuten lang laufen gelassen.

Die Nanoporen-Datenanalyse-Pipeline basiert auf Cardozo et al.30 und beginnt mit der Isolierung von Einfangereignissen aus dem Rohnanoporenstrom. Ein Einfangereignis tritt auf, wenn der Nanoporenstrom länger als eine Millisekunde auf 70 % oder weniger seines offenen Porenniveaus abfällt. Anschließend wird der Bruchteilstrom während jedes Einfangereignisses berechnet, der als der während des Einfangereignisses beobachtete Strom (Ib) geteilt durch den offenen Porenstrom (Io) definiert ist. Um mutmaßliche Erfassungsereignisse des Ausgabestrangs vom Hintergrundrauschen zu trennen, wird jedes Erfassungsereignis durch einen Filter geleitet, der prüft, ob fünf seiner Signalmerkmale (Mittelwert, Median, Minimum, Maximum, Standardabweichung) innerhalb des erwarteten Bereichs liegen. Die Signalfilterparameter wurden empirisch ermittelt. Konkret haben wir für jeden von uns getesteten Barcode Rohstromverteilungen für jeden Filterparameter aufgezeichnet (z. B. Rohstromverteilung des Signalmittelwerts) und unsere Parameterwerte so gestaltet, dass sie die Spitzenverteilung der Signalmerkmale jedes Barcodes einschließen. Erfassungsereignisse durchlaufen außerdem einen Längenfilter, der Ereignisse mit einer Erfassungsdauer von weniger als zwei Sekunden verwirft.

Die erste Untersuchung der Klassifizierung von Barcode-Set A wurde mit den Modellen LogisticRegression und RandomForestClassifier von scikit-learn durchgeführt. Jedes Modell wurde mit einer 80/20-Zug-/Testaufteilung an mindestens 14.000 Exemplaren pro Klasse angepasst. Die Klassifizierungsgenauigkeit ist definiert als die Anzahl der korrekten Vorhersagen (richtig positiv + richtig negativ), dividiert durch die Gesamtvorhersagen, umgerechnet in einen Prozentsatz.

Alle nachfolgenden Klassifizierungen von Erfassungsereignissen wurden von Convolutional Neural Networks (CNNs) über PyTorch durchgeführt. Für jedes Erfassungsereignis wird das erste Zwei-Sekunden-Fenster seines Roh-Nanoporensignals in ein 2D-Array umgeformt, bevor es in das CNN eingespeist wird. Das 4-Schicht-CNN besteht aus vier Faltungsschichten, jeweils mit ReLU-Aktivierung und maximalem Pooling, gefolgt von einer vollständig verbundenen Schicht mit Log-Sigmoid-Aktivierung und einer Ausgabeschicht, die ein Neuron für jede Barcode-Klasse enthält. Das ResNet-18-CNN-Modell wurde aus dem PyTorch-Unterpaket Torchvision.models bezogen. Die gemeldeten Genauigkeiten und Verwirrungsmatrizen stammen aus Testergebnissen des CNN nach einem Training mit mindestens 3.000 Beispielen pro Klasse für den 36-Wege-Klassifikator und mindestens 20.000 Beispielen pro Klasse für den 10-Wege-Klassifikator unter Verwendung einer 80/20-Trainings-/Testaufteilung für 250 Epochen. Für die Analyse mithilfe von Konfidenzschwellenwerten wurde die endgültige Ausgabeschicht des CNN als Maß für die Klassifizierungskonfidenz für jede Barcode-Vorhersage verwendet und Vorhersagen unterhalb eines voreingestellten Schwellenwerts (z. B. 0,9 oder 90 %) herausgefiltert.

Einfangereignisse einer bestimmten Klasse werden mithilfe einer Standardkurve (ermittelt aus Titrationsexperimenten) quantifiziert, die die durchschnittliche Zeit zwischen Einfangereignissen und der Probenkonzentration in Beziehung setzt. Die Zeit zwischen zwei Einfangereignissen an einer bestimmten Pore wird berechnet, indem die Endzeit des ersten Einfangs von der Startzeit des nachfolgenden Einfangs subtrahiert wird. Darüber hinaus werden auch alle Zeiträume zwischen diesen Einfangereignissen abgezogen, in denen die Pore mit Rauschen oder anderen Barcode-Einfangereignissen (wie durch unseren Filter und Klassifikator bestimmt) belegt war. Die durchschnittliche Zeit zwischen den Aufnahmen wird aus einer aggregierten Liste der Gesamtzeit zwischen den Aufnahmen aller funktionellen Poren in einem bestimmten Experiment berechnet. Erfassungsereignisse können auch anhand der Erfassungshäufigkeit quantifiziert werden, wie im nächsten Abschnitt beschrieben.

Die Erfassungsfrequenz f ist definiert als die Anzahl der Lesevorgänge für einen bestimmten Barcode-Strang pro gutem Kanal und Minute. Es wird mithilfe der folgenden Gleichung normalisiert, wobei fbackground und fsaturated die Erfassungsfrequenz des mit dem Strichcode versehenen Strangs darstellen, wenn sein Schaltkreis nicht aktiviert ist (kein Eingang) bzw. wenn er in einen stabilen Zustand versetzt wird (diese Werte wurden in separaten Experimenten ermittelt). .

Die Standardkurve in Abb. 1d umfasst drei Replikate, jedes mit einem unterschiedlichen Strichcode-Strang und alle erfolgreich. Die Schaltungskinetik-Experimente in Abb. 2c und 3e wurden unabhängig voneinander ohne Wiederholungen durchgeführt. Drei biologische Replikate wurden für die Fünf-Kreis-Multiplexing- (Abb. 4d) und Let-7-Variantenerkennungsexperimente (Abb. 5c) durchgeführt, wobei alle Replikate erfolgreich waren.

Für jedes der Dichtediagramme (Abb. 2b und 3b) und die trainierten ML-Modelle wurde die Probengröße durch die Barcode-Klasse mit der geringsten Anzahl von Einfängen bestimmt, die in Nanoporenexperimenten erhalten wurden.

Es wurden keine weiteren Daten von der Analyse ausgeschlossen. Es wurde keine Randomisierung oder Verblindung angewendet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Eine Teilmenge des gesamten in dieser Studie analysierten Datensatzes (Abb. 4d, Replikat 1) ist öffentlich verfügbar (https://doi.org/10.5281/zenodo.6846356). Der gesamte Datensatz oder bestimmte Teilmengen können ohne Einschränkungen auf Anfrage bezogen werden; Es ist zu diesem Zeitpunkt unerschwinglich groß (~600 GB), um öffentlich zugänglich gemacht zu werden. Wir werden uns bemühen, den Datensatz innerhalb einer angemessenen Frist von 7 Tagen zu versenden.

Der Datenanalyse-Pipeline-Code, der zum Extrahieren, Filtern, Klassifizieren und Quantifizieren von Nanoporen-Einfangereignissen verwendet wird, finden Sie unter https://github.com/uwmisl/dna-nanopore-computing (https://doi.org/10.5281/zenodo. 6829445). Benutzerdefinierte MinION MinKNOW-Laufskripts können auf Anfrage von Oxford Nanopore Technologies bezogen werden.

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Wir danken den Mitgliedern des Molecular Information Systems Lab für hilfreiche Diskussionen und Rückmeldungen zu dieser Arbeit. Wir danken auch Oxford Nanopore Technologies für die Bereitstellung des konfigurierbaren MinION-Laufskripts und die Diskussionen zu seiner Verwendung. Diese Arbeit wurde teilweise durch den NSF EAGER Award 1841188 und den NSF CCF Award 2006864 an LC und JN, den NSF CCF Award 1954665 an GS und JN sowie eine gesponserte Forschungsvereinbarung von Oxford Nanopore Technologies unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Karen Zhang, Yuan-Jyue Chen.

Paul G. Allen School of Computer Science and Engineering, University of Washington, Seattle, WA, USA

Karen Zhang, Delaney Wilde, Kathryn Doroschak, Luis Ceze, Georg Seelig & Jeff Nivala

Microsoft Research, Redmond, WA, USA

Yuan-Jyue Chen & Karin Strauss

Fakultät für Elektrotechnik und Informationstechnik, University of Washington, Seattle, WA, USA

Georg Seelig

Institut für Molekulartechnik und Wissenschaften, University of Washington, Seattle, WA, USA

Georg Seelig & Jeff Nivala

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KZ und DW führten Nasslaborexperimente durch. KZ und KD entwickelten die Datenanalyse-Pipeline und führten rechnerische Analysen durch. KZ, YC, GS und JN haben Experimente entworfen. YC, KS, LC, GS und JN betreuten das Projekt. JN konzipierte und leitete das Projekt. Alle Autoren haben an der Erstellung und Bearbeitung des Manuskripts mitgewirkt.

Korrespondenz mit Jeff Nivala.

YC und KS sind Mitarbeiter von Microsoft. JN ist Berater von Oxford Nanopore Technologies. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Zhang, K., Chen, YJ., Wilde, D. et al. Eine Nanoporenschnittstelle für DNA-Computing mit höherer Bandbreite. Nat Commun 13, 4904 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32526-3

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Eingegangen: 16. November 2021

Angenommen: 04. August 2022

Veröffentlicht: 20. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32526-3

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